Цитокины воспаление 2005 том

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

С.В. Сенников, А.Н. Силков

Обзор посвящен основным методам исследования цитокинов, используемым в настоящее время. Кратко охарактеризованы возможности и назначение методов. Приведены достоинства и недостатки различных методик подходов к анализу экспрессии генов цитокинов на уровне нуклеиновых кислот и на уровне продукции белка. (Цитокины и воспаление. 2005. Т. 4, № 1. С. 22-27.)

Ключевые слова: обзор, цитокины, методы определения.

Введение

Цитокины — это регуляторные белки, которые образуют универсальную сеть медиаторов, характерную как для иммунной системы, так и для клеток других органов и тканей. Под контролем этого класса регуляторных белков протекают все клеточные события: пролиферация, дифференцировка, апоптоз, специализированная функциональная активность клеток. Эффекты каждого цитокина на клетки характеризуются плейотропностью, спектр эффектов разных медиаторов перекрывается и, в основном, конечное функциональное состояние клетки зависит от влияния нескольких цитокинов, действующих синергично. Таким образом, система цитокинов представляет собой универсальную, полиморфную регуляторную сеть медиаторов, предназначенных для контроля процессов пролиферации, дифференцировки, апоптоза и функциональной активности клеточных элементов в кроветворной, иммунной и других гомеостатических системах организма.

С момента описания первых цитокинов прошло немного времени. Однако их исследование привело к выделению обширного раздела знаний — цитокинологии, являющейся неотъемлемой частью различных областей знания и, в первую очередь, иммунологии, давшей мощнейший толчок к изучению этих медиаторов. Цитокинология пронизывает все клинические дисциплины, начиная от этиологии и патогенеза заболеваний и заканчивая профилактикой и лечением различных патологических состояний. Следовательно, научным исследователям и клиницистам необходимо ориентироваться в разнообразии регуляторных молекул и иметь ясное представление о роли каждого из цитокинов в изучаемых процессах.

Методы определения цитокинов за 20 лет их интенсивного изучения прошли очень быструю эволюцию и сегодня представляют целую область научного знания. Перед исследователями в цитокинологии в начале работы стоит вопрос о выборе метода. И здесь исследователь должен точно знать, какую информацию ему нужно получить для достижения поставленной цели. В настоящее время разработаны сотни различных методов оценки системы цитокинов, которые дают разноплановую информацию об этой системе. Оценивать цитокины в различных биологических средах можно по специфической биологической активности. Можно определять их количественно с помощью целого ряда методов иммуноанализа, использующих поли- и моноклональные антитела. Кроме изучения секреторных форм цитокинов можно изучать их внутриклеточное содержание и продукцию в тканях методами проточной цитофлюориметрии, вестерн-блотинга и иммуногистохимии in situ. Очень важную информацию можно получать, изучая экспрессию мРНК цитокинов, стабильность мРНК, наличие изоформ мРНК цитокинов, естественных антисмысловых нуклеотидных последовательностей. Изучение аллельных вариантов генов цитокинов может дать важную информацию о генетически запрограммированной высокой или низкой продукции того или иного медиатора. У каждого метода есть свои недостатки и свои достоинства, своя разрешающая способность и точность определения. Незнание и непонимание исследователем этих нюансов может привести его к ложным выводам.

Определение биологической активности цитокинов

История обнаружения и первых шагов в изучении цитокинов была тесно связана с культивированием иммунокомпетентных клеток и клеточных линий. Тогда были показаны регуляторные эффекты (биологическая активность) ряда растворимых факторов белковой природы на пролиферативную активность лимфоцитов, на синтез иммуноглобулинов, на развитие иммунных реакций в моделях in vitro. Одна из первых методик определения биологической активности медиаторов — определение фактора миграции человеческих лимфоцитов и фактора ее ингибиции [1]. По мере изучения биологических эффектов цитокинов появлялись и различные методы оценки их биологической активности. Так, IL-1 определяли по оценке пролиферации мышиных тимоцитов in vitro, IL-2 — по способности стимулировать пролиферативную активность лимфобластов, IL-3 — по росту гемопоэтических колоний in vitro, IL-4 — по комитогенному эффекту, по усилению экспрессии Ia-белков, по индукции образования IgG1 и IgE и т.д. [4]. Список этих методов можно продолжать, он постоянно пополняется по мере обнаружения новых биологических активностей растворимых факторов. Главный их недостаток — нестандартность методик, невозможность их унификации. Дальнейшее развитие приемов определения биологической активности цитокинов привело к созданию большого числа клеточных линий, чувствительных к тому или иному цитокину, или мультичувствительных линий. Сейчас большинство этих цитокинчувствительных клеток можно обнаружить в списках коммерчески распространяемых клеточных линий. Например, для тестирования IL-1a и b используют клеточную линию D10S [18], для IL-2 и IL-15 — клеточную линию CTLL-2 [9], для IL-3, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, GM-CSF — клеточную линию TF-1 [13, 16], для IL-6 — клеточную линию B9 [5], для IL-7 — клеточную линию 2Е8 [11], для TNFa и TNFb — клеточную линию L929 [8], для IFNg — клеточную линию WiDr [19], для IL-18 — клеточную линию KG-1 [14].

Однако, подобный подход в изучении иммуноактивных белков, наряду с хорошо известными преимуществами, такими как измерение реальной биологической активности зрелых и активных белков, высокой воспроизводимостью при стандартизированных условиях, имеет и свои недостатки. К ним можно отнести, в первую очередь, чувствительность клеточных линий не к одному цитокину, а к нескольким родственным цитокинам, биологические эффекты которых перекрываются. Кроме того, нельзя исключить возможность индукции продукции других цитокинов клетками-мишенями, которые могут искажать тестируемый параметр (как правило, это пролиферация, цитотоксичность, хемотаксис). Мы знаем еще не все цитокины и не все их эффекты, поэтому оцениваем не сам цитокин, а суммарную специфическую биологическую активность. Таким образом, оценка биологической активности как суммарной активности разных медиаторов (недостаточная специфичность), является одним из недостатков этого метода. Кроме того, используя цитокинчувствительные линии, невозможно выявить неактивированные молекулы и связанные белки. Значит, подобные методики не отражают реальной продукции для ряда цитокинов. Еще один немаловажный недостаток использования клеточных линий — необходимость лаборатории для культуры клеток. Кроме того, все процедуры по наращиванию клеток, инкубированию их с исследуемыми белками и средами требуют больших временных затрат. Также нужно отметить, что клеточные линии при длительном их применении требуют обновления или повторной сертификации, так как в результате культивирования они могут мутировать и модифицироваться, что может приводить к изменению их чувствительности к медиаторам и снижению точности определения биологической активности. Тем не менее, этот метод идеален для тестирования специфической биологической активности рекомбинантных медиаторов.

Количественное определение цитокинов с помощью антител

Продуцируемые иммунокомпетентными и другими типами клеток цитокины выделяются в межклеточное пространство для осуществления паракринных и аутокринных сигнальных взаимодействий. По концентрации этих белков в сыворотке крови или в кондиционной среде можно судить о характере патологического процесса и об избытке или недостатке определенных функций клеток у больного.

Методы определения цитокинов с помощью специфических антител являются сегодня самыми распространенными системами детекции этих белков. Данные методы прошли через целую серию модификаций с использованием разных меток (радиоизотопных, флюоресцентных, электрохемилюминесцентных, ферментных и т.д.). Если радиоизотопные методы имеют ряд недостатков, связанных с использованием радиоактивной метки и ограниченной по времени возможностью использования меченых реагентов (период полураспада), то иммуноферментные методы нашли самое широкое распространение. Они основаны на визуализации нерастворимых продуктов ферментативной реакции, поглощающих свет с известной длиной волны, в количествах, эквивалентных концентрации определяемого вещества. Для связывания измеряемых веществ используются антитела, нанесенные на твердую полимерную основу, а для визуализации — антитела, конъюгированные с ферментами, как правило, щелочной фосфатазой или пероксидазой хрена [2, 3].

Достоинства метода очевидны: это высокая точность определения при стандартизованных условиях хранения реактивов и выполнения процедур, количественный анализ, воспроизводимость. К недостаткам можно отнести ограниченный диапазон определяемых концентраций, в результате чего все концентрации, превышающие определенный порог, считаются равными ему. Необходимо отметить, что затраты времени на выполнение метода варьируют в зависимости от рекомендаций производителя. Однако в любом случае речь идет о нескольких часах, необходимых для инкубаций и отмывок реагентов. Кроме того, определяются латентные и связанные формы цитокинов, которые по своей концентрации могут значительно превышать свободные формы, в основном, ответственные за биологическую активность медиатора. Поэтому данный метод желательно использовать вместе с методами оценки биологической активности медиатора.

Другая модификация метода иммуноанализа, которая нашла широкое применение — электрохемилюминесцентный метод (ЭХЛ) определения белков антителами, меченными рутением и биотином. Этот метод имеет следующие преимущества по сравнению с радиоизотопными и иммуноферментными: простота выполнения, небольшое время выполнения методики, отсутствие процедур отмывок, малый объем пробы, большой диапазон определяемых концентраций цитокинов в сыворотке и в кондиционной среде, высокая чувствительность метода и его воспроизводимость [17, 7, 21]. Рассматриваемый метод приемлем для использования как в научных исследованиях, так и в клинических.

Следующий метод оценки цитокинов в биологических средах разработан на основе технологии проточной флюориметрии. Он позволяет одновременно оценивать в образце до сотни белков. В настоящее время созданы коммерческие наборы для определения до 17 цитокинов [12]. Тем не менее, преимущества этого метода определяют и его недостатки. Во-первых, это трудоемкость подбора оптимальных условий для определения нескольких белков, во-вторых, продукция цитокинов носит каскадный характер с пиками продукции в разное время. Поэтому определение большого количества белков одномоментно не всегда информативно.

Общим требованием методов иммуноанализа, использующих т.н. «сэндвич», является тщательный подбор пары антител, позволяющий определять либо свободную, либо связанную форму анализируемого белка, что накладывает на этот метод ограничения, и что всегда нужно учитывать при интерпретации полученных данных. Этими методами определяется суммарная продукция цитокинов разными клетками, в то же время об антигенспецифической продукции цитокинов иммунокомпетентными клетками судить можно только предположительно.

В настоящее время разработана система ELISpot (Enzyme-Liked ImmunoSpot), которая в значительной степени устраняет эти недостатки. Метод позволяет полуколичественно оценивать продукцию цитокинов на уровне отдельных клеток [6]. Высокая разрешающая способность этого метода позволяет оценивать антиген-стимулированную продукцию цитокинов, что очень важно для оценки специфического иммунного ответа.

Следующий, широко используемый в научных целях, метод — это внутриклеточное определение цитокинов методом проточной цитофлюориметрии [20]. Преимущества его очевидны. Мы можем фенотипически охарактеризовать популяцию клеток-продуцентов цитокина и/или определить спектр продуцируемых цитокинов отдельными клетками, при этом имеется возможность относительной количественной характеристики этой продукции. Вместе с тем, описываемый метод достаточно сложен и требует дорогостоящего оборудования.

Следующая серия методов, которая используется в основном в научных целях — это иммуногистохимические методы с использованием меченых моноклональных антител. Преимущества очевидны — определение продукции цитокинов непосредственно в тканях (in situ), где происходят различные иммунологические реакции. Однако рассматриваемые методы очень трудоемки и не дают точных количественных данных.

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Л.П. Алексеев, Р.М. Хаитов

Под термином «клиническая иммуногенетика» следует понимать использование на практике данных о генетическом контроле иммунного ответа человека. Объектом клинической иммуногенетики является так называемый главный комплекс гистосовместимости человека (МНС, от англ. Major Histocompatibility Complex). Это название отражает скорее историю открытия данной генетической системы, чем ее основную функцию. История открытия первых продуктов генов главного комплекса гистосовместимости, называемых у человека антигенами HLA (от англ. Human Leukocyte Antigens), связана именно с появлением и развитием трансплантационной иммунологии, когда возникла необходимость подбора тканесовместимых пар донора и реципиента. Сегодня же мы знаем, что роль системы МНС в отторжении трансплантата является лишь одной из частных физиологических функций этой системы.

Система HLA, обеспечивая регуляцию иммунного ответа, осуществляет важнейшие физиологические функции: взаимодействие всех иммунокомпетентных клеток организма, распознавание своих и чужеродных, в том числе измененных собственных клеток, запуск и реализацию иммунного ответа, обеспечение временной толерантности организма матери к тканенесовместимому плоду в период его вынашивания и, в целом — обеспечивает выживание человека как вида в условиях экзогенной и эндогенной агрессии.

Система HLA осуществляет регуляцию функций иммунной системы человека. В 80-х гг. даже дискутировался вопрос о ее переименовании в «главный комплекс генов иммунного ответа человека», но поскольку старое историческое название укоренилось среди исследователей, решено было не менять его. Система HLA, открытая более 40 лет назад, по-прежнему остается одной из самых сложных, наиболее хорошо изученных и, вместе с тем, загадочных генетических структур в геноме человека. Так, если еще в 1987 г. расстояние между его условными границами оценивалось в 2000 тыс. п.о., то сегодня оно расширено более чем в 2 раза, причем протяженность отдельных его элементов — генных кластеров — колеблется в широких пределах в зависимости от HLA-гаплотипа. Все HLA-гены локализованы в коротком плече хромосомы 6 и разделяются на три группы, экспрессирующие охарактеризованные гены, псевдогены и гены с неустановленной функцией.

Когда основным объектом исследования служили только белки-антигены HLA, представления о комплексе генов HLA формировались в основном на анализе косвенных данных, включающих изучение HLA-антигенов в популяциях, в семейном анализе, в реакциях, субстратом которых были HLA-антигены и т. д. Благодаря развитию молекулярной генетики и молекулярной иммунологии появилась возможность не только проводить тонкий анализ антигенов HLA, но и изучить сами гены HLA. Особенный прогресс в этом направлении произошел после открытия и внедрения в исследования системы HLA метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющего анализировать необходимые для исследований участки ДНК, что, в свою очередь, открывало широкие возможности для быстрого и точного анализа молекулярного полиморфизма системы HLA.

Внедрение в исследования системы HLA молекулярно-генетических методов не только позволило конкретизировать представления о системе HLA, но и значительно расширило представления о ее полиморфизме. Были открыты многие новые аллели классов I, II и III, а общее количество только известных специфичностей HLA классов I и II увеличилось более чем в 10 раз и в настоящее время превышает 2000.

Нарушение или полное отсутствие какой-либо из функций системы HLA лежит в основе целого ряда патологий, в том числе онкологических и аутоиммунных заболеваний.

Одной из важнейших физиологических функций системы HLA, лежащей в основе развития и регуляции иммунного ответа, является обеспечение процессинга и представления иммунодоминантных пептидов, являющихся продуктом внутриклеточного протеолиза чужеродных антигенов, против которых и будет индуцирован, а затем — будет развиваться иммунный ответ. Этой функции антигенов системы МНС способствует строение ее молекул, которое, несмотря на выраженные различия в структуре антигенов класса I и II молекул HLA, позволяет образовать на внешнем их конце т. н. пептид-связывающую бороздку, в которой и удерживается представляемый для распознавания пептид.

Антигенпредставляющая клетка осуществляет свое специфическое взаимодействие, представляя пептид в контексте собственной молекулы HLA, идентичной таковой на клетке, воспринимающей информацию. Именно за установление этого феномена, названного феноменом двойного распознавания, Цинкернагель и Догерти были удостоены Нобелевской премии. Это открытие стало ключевым в понимании основ физиологической регуляции иммунного ответа. Имеются существенные различия между взаимодействием, обеспечиваемым в процессе иммунного ответа антигенами HLA классов I и II. Антигены HLA класса II обеспечивают взаимодействие антигенпредставляющей клетки с Т-хелпером, а антигены HLA класса I — c Т-эффектором-киллером. В этом им помогают различные молекулы-корецепторы: CD4 — для Т-хелперов и CD8 — для Т-киллеров. Естественно, что различным будет и эффект этого взаимодействия. Так, распознавание пептидов в контексте молекулы HLA класса II ведет к формированию популяции клеток Тh1 и Тh2, одни из которых индуцируют развитие гуморального иммунного ответа (Тh2), а другие явятся необходимым компонентом в индукции Т-киллеров (Тh1). Что же касается антигенов гистосовместимости класса I, то Т-киллер, индуцированный против иммунодоминантного пептида, экпрессированного на поверхности клеток-мишеней в контексте антигенов HLA класса I, идентичных таковым, экспрессированным на Т-киллере, уничтожит эти клетки-мишени. Следует еще раз подчеркнуть, что оба эти важнейших звена иммунного ответа строго ограничены набором антигенов HLA, кодируемых конкретным аллельным вариантом, характерным для конкретного человека. В том случае, если бы пептид был представлен для распознавания клеткой, отличающейся по HLA-антигенам от распознающих клеток, то иммунный ответ развивался бы против этих представляющих клеток, т. е. в этом случае речь будет уже идти о развитии трансплантационного иммунитета.

Роль одного из этих генов, а именно ТАР установлена в развитии ряда заболеваний человека. В их основе лежит вызванная мутацией утрата функции представления антигенов HLA класса I, что ведет к развитию онкологических заболеваний, в связи с тем, что на клетках «исчезает» мишень для Т-киллеров и NK-клеток, осуществляющих «противораковый надзор» в организме. Также имеются данные о том, что при синдроме Луи-Бар, характеризующемся наличием «голых Т-лимфоцитов», нарушение экспрессии антигенов HLA класса I, связано с гомозиготным состоянием аллелей гена ТАР2.

Для понимания механизмов участия HLA-антигенов в патологических процессах необходимо знать, каким именно образом иммунодоминантный пептид, происходящий из чужеродного агента, может не только индуцировать развитие «физиологического» иммунного ответа, направленного на элиминацию данного патогена, но одновременно с этим может «запустить» развитие аутоиммунного процесса. Дело в том, что каждый из пептидов связывается (и удерживается в антигенпредставляющей складке молекулы HLA) с конкретным участком, характерным для белковой структуры антигенсвязывающего участка.

Таким образом, в связь с конкретным пептидом вовлекаются конкретные же участки HLA-антигенов, кодируемые различными аллельными вариантами генов HLA, что, по сути, и является основой генетического контроля иммунного ответа. Это положение хорошо иллюстрируют данные о том, что, например, пептид вируса герпеса связывается с гаплотипом HLA-DQA1*0501/-DQB1*2001, но не HLA-DQA1*0201/-DQB1*2001. Различие между ними в цепи DQA1 составляет 15 аминокислотных остатков. Установление этого факта и имеющаяся в настоящее время возможность анализировать аминокислотные последовательности всех аллельных вариантов антигенов HLA, включая участки, определяющие их специфичность, а также структуру пептидов, определяющих специфичность различных чужеродных агентов, включая болезнетворные, позволяет заранее предсказать соответствие тех или иных иммунодоминантных пептидов тем или иным участком молекулы МНС. Таким образом, можно заранее предсказать генетическую отвечаемость или неотвечаемость на тот или иной агент.

В свою очередь, это даст возможность не только заранее решить вопрос о том, ответит ли данный индивидуум на вакцинацию против болезнетворного агента, но и предсказать, насколько этот ответ будет физиологичен. Это, в свою очередь, позволит прогнозировать возможность развития ряда заболеваний аутоиммунного генеза (например, ревматоидный артрит и ИЗСД), в генезе которых, возможно, лежит также комплементарность иммунодоминантных пептидов инфекционных агентов конкретным эпитопам аллелей HLA.

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья