Фагоцитарная реакция при воспалении
Фагоцитоз – активный захват и поглощение живых клеток или каких-либо небольших частиц одноклеточными организмами либо особыми клетками – фагоцитами. Фагоцитоз – одна из защитных реакций организма, главным образом при воспалении. Открыт И.И.Мечниковым в 1882 году.
При значительной вирулентности микроба и при достаточной инфекционной дозе кожные и слизистые барьеры могут оказаться совершенно недостаточными, и микроб проникает в кожу, слизистые оболочки либо в подкожный или в подслизистый слой. В значительном числе случаев при этом развивается воспалительный процесс. Изучение роли этого процесса в защите организма от микробов связано с именем И.И. Мечникова.
Мечников изучал функции зародышевых листков, в частности среднего зародышевого листка – мезодермы у эмбрионов беспозвоночных животных; вводя в организм губки какое-либо постороннее тело (стеклянный капилляр), он наблюдал, что оно окружалось подвижными амебовидными клетками мезодермы, способными заглатывать различные инертные частицы. Аналогичный процесс – устремление лейкоцитов, окружение и поглощение ими инородного тела, вызывающего воспалительный процесс – наблюдался и у других видов животных, как имеющих кровеносную систему, так и лишённых её. Этот процесс поглощения клетками микробов и других корпускулярных элементов И.И. Мечников назвал фагоцитозом. Многочисленные исследования, поставленные с различными микробами, позволили Мечникову сделать заключение о превалирующем значении фагоцитоза в воспалительных процессах и о защитной функции самого процесса воспаления. Фагоцитоз в воспалительной реакции является действительно одним из существенных механизмов защиты на всех ступенях зоологической лестницы. Однако защитный механизм воспалительной реакции оказался сложнее, чем это можно было думать, и фагоцитоз не исчерпывает всех тех возможностей защиты, которые несёт с собой воспалительный процесс. В механизме воспаления существенную роль играют гистамин и серотонин, освобождающиеся главным образом из тучных клеток. Они влияют на проницаемость стенок капилляров и основного вещества соединительной ткани и усиливают фагоцитарную активность эндотелия и мезенхимы. Существенное значение имеют глобулиновый фактор проницаемости и его ингибитор, а также многие другие вещества типа ферментов, меняющиеся на различных стадиях воспалительного процесса.
Воспалённая ткань способна фиксировать также белки и инертные частицы. Чужеродный белок, введенный в зону воспаления в коже или в брюшной полости, задерживается на более длительный период, чем в нормальных тканях, причём задержка в коже более длительна, чем в брюшной полости. Подобные же задержки в очаге воспаления наблюдались при введении красок в брюшную полость. Следовательно, воспалительный процесс, независимо от того, протекает ли он в иммунном или не иммунном организме, препятствует диссеминации микробов. Но возникает он не сразу после внедрения микроба, даже в тех случаях, когда микроб, например стафилококк, обладает способностью вызывать наиболее сильное воспаление. Если микробы обладают большой инвазионной способностью, некоторая часть их проникает в организм раньше, чем воспалительная реакция возникнет и станет настолько интенсивной, что сможет препятствовать диссеминации возбудителя. Скорость возникновения острой воспалительной реакции зависит от характера раздражителя. Также существенное значение имеет и стадия воспалительного процесса. Первые этапы воспалительной реакции сопровождаются активной гиперемией и ускоренным током крови и лимфы. В этот период бактерии могут быстро уноситься с места введения, что может способствовать развитию инфекционного процесса. Однако эта стадия весьма непродолжительна, и наступающие вскоре сосудистые расстройства и приток лейкоцитов препятствуют распространению инфекции. Таким образом, воспалительная реакция является механизмом защиты, препятствующим диссеминации микробов, но вступающим в действие не сразу же после внедрения микробов в организм, а по истечении нескольких часов. В последней стадии воспалительного процесса, когда в зоне воспаления скапливаются громадные количества лейкоцитов, имеет место и интенсивное уничтожение оставшихся микробов благодаря фагоцитозу.
Механизм фиксации и аккумуляции микробов и инородных веществ в зоне воспаления сложен. Лимфатическая блокада, возникающая в воспалительной зоне вследствие стаза и свёртывания лимфы, является одним из основных факторов, препятствующих диссеминации микробов из воспалительного очага. Эта блокада образует механический барьер, состоящий из коагулированной плазмы, и представляет собой значительное препятствие для прохождения микробов. При остром воспалительном процессе наблюдается не замедление, а ускорение тока лимфы через зону воспаления, и бактерии, и другие инородные частицы фиксируются в этой зоне благодаря действию различных физико-химических факторов.
Значительную роль в фиксации и уничтожении микробов в воспалительном очаге играют фагоцитоз и антитела.
Лейкоциты, которые в изобилии скапливаются в зоне воспаления, образуют своеобразный вал, препятствующий диссеминации организмов. Наряду с этим клеточные элементы лейкоцитарного вала активно уничтожают возбудителя. Повышение капиллярного давления и увеличение проницаемости капилляров, имеющие место при воспалении, вызывают увеличение количества жидкости, проникающей через эндотелий капилляров. Воспалительная зона обогащается содержащимися в крови веществами, в том числе и антителами (нормальными и иммунными). Антитела, воздействуя на бактерии, делают их более доступными клеточным факторам защиты и задерживают их в зоне воспаления. Возможно, что алексин, бетализин, и другие неспецифические факторы защиты, концентрируясь в зоне воспаления, играют роль в сложном механизме защиты, обусловленном воспалительной реакцией.
Как известно, основным свойством фагоцитов является их способность к внутриклеточному перевариванию. Однако не всегда и не в отношении всех микробов эта способность выражена в должной степени. Иногда микробы, захваченные фагоцитами, не только не перевариваются ими, но сохраняются и размножаются в них (незавершённый фагоцитоз). В этом случае фагоцитоз не является защитной реакцией организма, а наоборот, защищает микробы от бактерицидных свойств организма. Однако такое явление встречается редко. Другой особенностью фагоцитов является их положительный химиотаксис в отношении микробов и их продуктов. Положительный химиотаксис и обусловливает возможность уничтожения проникающих в организм микробов скапливающимися в месте их проникновения лейкоцитами. Однако большие дозы микробов или токсинов могут вызвать отрицательный химиотоксис, и тогда фагоцитарная реакция не может быть реализована. При воспалительной реакции имеет место значительное скопление лейкоцитов, которые проходят через стенки сосудов вследствие химиотоксического притяжения. Гной, накапливающийся при воспалительных процессах, и представляет собой эти скопления.
Но и при отсутствии воспаления защитная роль фагоцитоза может быть обнаружена вполне демонстративно. При введении иммунному животному микробов последние немедленно захватываются фагоцитами; так, например, вводя культуру сибирской язвы лягушке, можно наблюдать, что через некоторое время все микробы фагоцитируются, и инфекция не развивается. Тоже можно наблюдать при введении самых разнообразных непатогенных микробов любому животному. В восприимчивом организме фагоцитоз либо вовсе не наблюдается, либо наблюдается только в незначительной степени. Фагоциты способны захватывать живых микробов. Если взять у лягушки, получившей культуру сибиреязвенных бацилл, экссудат, содержащий лейкоциты, целиком захватившие всех бацилл, и ввести его морской свинке, последняя погибнет от сибирской язвы, так как лейкоциты лягушки, попав в неподходящую среду в организме морской свинки, погибают и освобождают таким образом заключённых в них вполне вирулентных микробов. Доказательством несомненного значения фагоцитоза как защитного механизма организма является также то обстоятельство, что подавление фагоцита или создание для него препятствий понижает резистентность организма. Если споры столбняка хорошо отмыть от токсина и ввести в животный организм, то они быстро фагоцитируются, причём заболевания столбняком не наступит. Однако если ввести эти споры в ватном тампоне, когда лейкоциты не смогут их поглотить или сделают это с большим опозданием, споры успевают прорасти и наступает заболевание и смерть. Если ввести культуру микробов вместе с молочной кислотой, обладающей отрицательным химиотоксическим действием на лейкоцитов, смерть наступит от такой дозы культуры, которая без кислоты легко переносится животным. С другой стороны, увеличение количества лейкоцитов, особенно в месте внедрения инфекции, несомненно, повышает резистентность организма. Оно может быть вызвано и неспецифическими агентами. Несомненно, что лейкоцитоз является одним из факторов неспецифического иммунитета, который воспроизводят при так называемой протеинотерапии.
Связывание (адсорбция) лейкоцитами токсинов многократно было описано разными авторами в отношении как дифтерийного, так и столбнячного токсина, хотя полученные результаты были довольно противоречивы.
Реакция фагоцитоза имеет защитную функцию не при всех инфекционных заболеваниях. Например, при менингите, вызванном палочкой инфлюэнцы, последняя поглощается, но не разрушается фагоцитами, защищающими её от действия антител. Но при подавляющем большинстве бактерийных инфекций фагоцитоз в той или иной мере несёт защитные функции. Иное значение имеет фагоцитоз при вирусных инфекциях. Фагоцитарная реакция не при всех инфекционных процессах оказывается равнозначной. Это вполне соответствует взглядам И.И. Мечникова, который при изучении фагоцитарных реакций у различных животных и с различными микробами установил различные формы этой реакции в её эволюционном развитии. Стафилококк захватывается и убивается лейкоцитами, гонококк фагоцитируется ими, но остаётся живым внутри лейкоцитов, и, наконец, некоторые вирусы вообще не фагоцитируются лейкоцитами. Возможно, что эти три примера представляют собой три различные стадии эволюционного развития фагоцитарной реакции.
Занятие 10. Фагоцитарная реакция при воспалении
Цель занятия
Изучить стадии развития фагоцитоза при воспалении.
Подготовка к занятию
Студенты готовятся к данному занятию в объеме следующих вопросов.
1. Фагоцитоз как защитная реакция организма при воспалении.
2. Учение И. И. Мечникова о воспалении.
3. Современные данные о механизме фагоцитарной реакции.
4. Связь фагоцитарной реакции с реактивностью организма.
Техническое оснащение занятия*
* ()
Для изучения фагоцитоза в висячей капле*
* ()
Для изучения фагоцитоза в мазке
Наименование опытов и методика их проведения
Опыт 1. Фагоцитоз птичьих эритроцитов в брюшной полости морской свинки. В начале занятия берут заранее подготовленную морскую свинку (крысу), у которой в экссудате полости живота установлено скопление макрофагов. Выстригают шерсть по срединной линии кзади от пупка и шкуру протирают эфиром и йодной настойкой. Набирают в шприц 3 мл 3% взвеси эритроцитов петуха, подогретой до 38°, производят прокол иглой на 6-8 см кпереди от лонного сращения, строго по срединной линии живота, в положении животного вниз головой. При этом задние лапки животного оттягивают назад и в стороны. Взвесь эритроцитов вводят в полость живота не быстро и отмечают время введения.
Через 15 минут у подопытного животного ножницами надрезают кожу живота по срединной линии кзади от пупка; в месте надреза стерильной пастеровской пипеткой прокалывают брюшину и в пипетку набирают 1-1,5 мл экссудата. Для приготовления висячей капли переносят 5-7 капель экссудата на часовое стекло и смешивают с равным количеством капель краски нейтральной красной. Затем каждый студент изготовляет из экссудата мазок и препарат висячей капли. Через каждые 15-20 минут после первой пробы берут вторую и третью пробу экссудата и изготовляют мазки и препараты висячей капли. В промежутках между взятием проб экссудата фиксируют и окрашивают мазки, затем изучают картину фагоцитоза в висячей капле. Мазки изучают после обработки третьей пробы. Картины фагоцитоза в каждой висячей капле и в каждом мазке зарисовывают и составляют протокол опыта.
Приготовление висячей капли и исследование ее под микроскопом
1. На стекле с лункой делают непрерывный ободок из вазелина вокруг лунки. На протертое покровное стеклышко в центре помещают каплю экссудата, смешанного с индикатором нейтральный красный, величиной с булавочную головку. Покровное стеклышко накрывают стеклом с лункой так, чтобы капля проецировалась на середину лунки, но не прикасалась к ней. Затем весь препарат переворачивают покровным стеклом вверх, при этом капля экссудата повисает над лункой. Вазелиновый ободок обеспечивает герметичность лунки, чем предупреждается высыхание капли.
2. При малом увеличении микроскопа с суженной диафрагмой или с опущенным конденсатором отыскивают край капли и на фоне желтовато-зеленых овальных эритроцитов находят красный комочек и помещают его в центр поля зрения, после чего устанавливают большое увеличение (объектив 40).
3. Теперь красный комочек предоставляется макрофагом, внутри которого видны ярко-красные эритроциты. В зависимости от стадии фагоцитоза макрофаг может фиксировать на своей поверхности до 10-20 эритроцитов (желто-зеленого цвета), внутри макрофага будут находиться то цельные эритроциты, то их ядра, окруженные тонким ободком протоплазмы, то, наконец, лишь обломки ядер и зерна. В процессе ферментолиза поглощенные эритроциты окрашивают в присутствии индикатора нейтральный красный в розовый, а затем в рубиново-красный цвет, что указывает на изменение реакции в кислую сторону. Эритроциты нефагоцитированные, а также свободные от эритроцитов макрофаги своей обычной окраски не меняют.
Приготовление мазка и изучение его под микроскопом
1. Небольшую каплю экссудата помещают на предметное стекло на сантиметр от его узкого края и шлифованным ребром другого стекла делают длинный и широкий мазок. Высохший мазок помещают на решетку ванночки и заливают краской Май-Грюнвальда на 5 минут, затем добавляют приблизительно равное количество дистиллированной воды и мазок докрашивают еще в течение 3-5 минут. В первой фазе окрашивания необходимо подливать краску дополнительно, так как она быстро испаряется (иначе мазок будет испорчен). По окончании окрашивания краску сливают в ванночку, мазок промывают водопроводной водой и высушивают полосками фильтровальной бумаги*.
* ()
2. Высушенный мазок рассматривают под микроскопом с иммерсионной системой. В мазке определяют все фазы фагоцитоза и зарисовывают их.
При воздействии на организм многообразных повреждающих факторов физической, химической и биологической природы возникает сложная неспецифическая защитно-приспособительная реакция организма — воспаление. Воспаление — местная реакция кровеносных сосудов, соединительной ткани и нервной системы на повреждение. В процесс воспаления вовлекаются лимфатические структуры, сосудистая сеть и локально повреждаемые ткани. Сначала нарушается обмен жидкости, что ведет к нарушению циркуляции в капиллярах. Одно из серьезных изменений — повышение проницаемости капилляров.
Итогом воспалительной реакции является локализация микроорганизмов (или отграничение вызванного ими очага поражения) с последующей их элиминацией и частичным или полным восстановлением нарушенных структур.
Первым звеном воспалительной реакции являются сосудистые изменения, выражающиеся прежде всего в повышении проницаемости стенки сосудов, связанной, главным образом, с действием биологически активных веществ (гистамин, серотонин, кинины), выделяющихся при повреждении клеток, особенно тучных. Повышение сосудистой проницаемости ведет к периваскулярной экссудации плазмы («серозный отек») и обусловливает миграцию клеток-фагоцитов (нейтрофилы, макрофаги) в пораженные участки ткани.
Указывают на роль воспалительного отека (скопление экссудата в воспалительной ткани) как фактора, способного связывать, фиксировать бактериальные токсины в очаге воспаления и не допускать их всасывания и распространения в организме. Особенно большое защитное значение имеют фагоцитарная и пролиферативная функции клеток – гистиоцитов, макрофагов. Грануляционная ткань, которую они образуют, представляет мощный защитный барьер против инфекции.
Фагоциты могут быть причислены к главным факторам воспаления. Особую роль при этом играют тканевые макрофаги, обладающие способностью поглощать и переваривать различные чужеродные для организма агенты, включая микроорганизмы. Защитные свойства фагоцитов связаны с наличием в их цитоплазме большого числа лизосом — органелл, богатых различными гидролитическими ферментами, обеспечивающими расщепление значительного числа химических связей. Процесс фагоцитоза нередко сопровождается гибелью клетки-фагоцита, однако при этом происходит гибель большого числа микроорганизмов.
Фагоцитоз — общебиологическое неспецифическое явление, которое может быть отнесено филогенетически к высокому уровню распознаваемости чужеродности. Фагоцитирующие клетки мезенхимы приобрели в процессе эволюции определенную специализацию и стали поглощать широкий спектр посторонних частиц, таких, как микроорганизмы, макромолекулярные комплексы aнтиген-антитело, клетки и их органеллы, вирусы, коллоидальные растворы красок и др. Важнейшее свойство фагоцитов состоит в их способности распознавать «не свое», что ставит, эту реакцию на переходную ступень между неспецифической резистентностью н специфическим иммунитетом.
Клетки, обладающие способностью к фагоцитозу и пиноцитозу, подразделяют на две основные категории фагоцитов — мононуклеарные и полинуклеарные («макрофаги» и «микрофаги» по И. И. Мечникову).
Процесс фагоцитоза протекает в несколько ступеней. На первой стадии распознавания основную роль играет клеточная мембрана, которая благодаря своим рецепторам (Fc—рецепторы) обеспечивает контакт с объектом фагоцитоза. Погружение чужеродной частицы внутрь макрофага связано со сложными изменениями физико-химических свойств его цитоплазмы. Вначале актиноподобный белок макрофага полимеризуется, а затем полимеры сокращаются под действием миозина с кофактором. В итоге образуются псевдоподии, захватывающие фагоцитируемую частицу. Фагоцитирующая вакуоль (фагоцитируемый агент, окруженный плазматической мембраной фагоцита и погруженный внутрь цитоплазмы) соприкасается с лизосомальными гранулами фагоцита. При слиянии вакуоли с лизосомами образуется фаголизосомальная (пищеварительная) вакуоль. Через непродолжительное время в вакуоли может наступить гибель захваченной частицы (например, бактерии). Этому способствуют метаболиты фагоцита и лизосомальные ферменты (завершенный фагоцитоз).
Микробоцидную деятельность осуществляет молочная кислота, образующаяся в результате гликолиза и понижающая внутривакуольный рН до 4,0, затем перекись водорода, являющаяся результатом окисления никотиндиамид-адениннуклеотида в редуцированном фосфорилированном состоянии. Лизосомы содержат в себе более тридцати различных ферментов, способных гидролизировать большую часть захваченных объектов. В гранулах лейкоцитов найдены и другие микробоцидные вещества, например, катионные белки, лактоферрин, различные пероксидазы, активные также в отношении и вирусов.
Однако, не во всех случаях происходит гибель, а ряд возбудителей могут даже размножаться в фагоците и погубить его (незавершенный фагоцитоз).
Доступность клеток для определения фагоцитарной активности микрофагального (нейтрофилы) или макрофагального (моноциты) фагоцитоза представлена на схеме 1.
Схема 1. Локализация фагоцитирующих клеток и их доступность для исследования.
| Костный мозг | Кровь | Ткань |
| Палочкоядерные и сегментоядерные нейтрофилы Моноцит | Нейтрофилы воспалительного очага Тканевой макрофаг |
Для оценки фагоцитарной активности лейкоцитов периферической крови к цитратной крови, взятой из пальца, в объеме 0,2 мл, добавляют 0,25 мл взвеси микробной культуры с концентрацией 2 млрд. микробов в 1 мл. Смесь инкубируют 30 мин при 37°С, центрифугируют при 1500 об/мин в течение 5-6 мин, удаляют надосадочную жидкость. Осторожно отсасывают тонкий серебристый слой лейкоцитов, готовят мазки, сушат, фиксируют, красят краской Романовского-Гимза. Препараты сушат и микроскопируют.
Подсчет поглощенных микробов ведут в 200 нейтрофилах (50 моноцитов). Интенсивность реакции оценивают по следующим показателям:
1. Фагоцитарный показатель (фагоцитарная активность) — процент фагоцитов из числа сосчитанных клеток.
2. Фагоцитарное число (фагоцитарный индекс) — среднее число микробов, поглощенное одним активным фагоцитом.
Для определения переваривающей способности лейкоцитов периферической крови готовят смесь взятой крови и суспензии микроорганизма и выдерживают в термостате при 37°С 2 часа. Приготовление мазков аналогично. При микроскопии препарата жизнеспособные микробные клетки увеличены в размерах, переваренные же менее интенсивно окрашены, меньших размеров. Для оценки переваривающей функции используют показатель завершенности фагоцитоза – отношение количества переваренных микробов к общему числу поглощенных микробов, выраженное в процентах.
Для оценки активности фагоцитоза используют также тест восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест).
Принцип метода основан на восстановлении поглощенного фагоцитом растворимого красителя (нитросинего тетразолия) в нерастворимый диформазан. НСТ-тест интегрально характеризует кислородзависимые антиинфекционные системы фагоцита.
В две пробирки, содержащие по 0,05 мл раствора гепарина, вносят по 0,1 мл крови и после перемешивания в одну из них добавляют 0,05 мл суспензии зимозана, а в другую — 0,05 мл раствора Рингера, затем в обе пробирки вносят по 0,05 мл раствора нитросинего тетразолия и инкубируют в водяной бане при 37°С 30 мин, встряхивая каждые 10 мин. После инкубации содержимое перемешивают, делают мазки, фиксируют, окрашивают красителем для НСТ-теста, нанося на стекла 5-7 капель красителя на 1,5 мин, добавляют такое же количество дистиллированной воды. Выдерживают в течение 30 мин, промывают.
При микроскопии препаратов в каждом случае подсчитывают 100 нейтрофилов (25 моноцитов), среди которых выделяют процент клеток, содержащих отложения диформазана (НСТ-позитивные), далее подсчитывают индекс активизации нейтрофилов (моноцитов) по формуле:
100(25)
где А — количество клеток, не содержащих диформазановых отложений или содержащих их в виде пылевидных немногочисленных включений;
В — количество клеток, в которых площадь отложения диформазана, не превышает 1/3 площади ядра; С -количество клеток, в которых названные отложения занимают oт 1/3 до всей величины площади ядра; Д — количество клеток с диформазановыми включениями по площади превосходящими площадь ядра.
Активность фагоцитоза обусловлена не только набором его лизосомальных ферментов и синтезируемых ими веществ, но и состоянием проницаемости лизосомной мембраны. Устойчивость к фагоцитозу определяется поверхностными свойствами микробной клетка, наличием факторов типа лейкотоксинов и антифагинов, инактивацией биоксидантов и пр.(Табл. 9)
Таблица 9.
Интенсивность реакции фагоцитоза для человека (норма, нейтрофилы)
| Показатели | Дети | Взрослые |
| Фагоцитарный показатель в % Фагоцитарное число Показатель завершенности фагоцитоза в % НСТ-тест (индекс активности нейтрофилов) | 0,1 – 0,15 | 75-80 14-15 55-60 0,1 – 0,15 |